核糖体展示技术的介绍
核糖体展示技术(Ribosome Display Technology, RDT)是由Plückthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基础上改进而来的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术,它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核糖体上, 形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体,使目的蛋白的基因型和表型联系起来,可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等。运用此技术已成功筛选到一些与靶分子特异结合的高亲和力蛋白质, 包括抗体、 多肽、 酶等, 是蛋白质筛选的重要工具。
核糖体展示技术的原理
核糖体展示技术通过聚合酶链反应 (PCR)扩增DNA文库,同时引入T7 启动子、核糖体结合位点及茎-环结构, 将其转录成 mRNA, 在无细胞翻译系统中进行翻译, 使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面, 形成 “mRNA-核糖体-蛋白质” 复合物, 构成核糖体展示的蛋白文库, 然后用相应的抗原从翻译混合物中进行筛选, 以乙二胺四乙酸 (EDTA) 解离结合的核糖体复合物或以特异抗原洗脱整个复合物,并从中分离mRNA。通过反转录聚合酶链反应(RT- PCR) 提供下一轮展示的模板, 所得 DNA进入下一轮富集,部分 DNA可通过克隆进行测序分析等。Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库 中筛选多肽配体。在此之前 , 利用前期多肽抗体进 行免疫沉淀 , 已经分离到了与核糖体和多肽偶联的mRNA。 Mattheakis等人首次将前 人的设想付诸 实践,建立了筛选多肽类配体的多聚核糖体展示技术,并从一个库容为10^12的肽库中,筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固定化 单抗 的多肽 配 体。 Gersuk等人利用该技术也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外翻译时,蛋白或多肽的折叠与 翻译同步进行u。与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。这些研究结果说 明, 如果某种蛋 白质 的折叠不受核糖体蛋 白通道的影响, 那么与核糖体的 解离就不是该蛋 白获得天然构像的必要条件。1 9 9 7 年,Plückthun实 验 室 在 以上 研 究 成 果 的 基 础 上 , 对 M a t t h e a k i s的多聚核糖体展示技术 进行 了改进, 建立了体外筛选完整功能蛋 白( 如抗体 ) 的新技术 :核糖体展示技术。
基因表达调控的主要环节是
基因表达调控的主要环节是转录的起始。基因表达调控是生物体内基因表达的调节控制,使细胞中基因表达的过程在时间、空间上处于有序状态,并对环境条件的变化作出反应的复杂过程。基因表达的调控可在多个层次上进行,包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控。基因表达调控是生物体内细胞分化、形态发生和个体发育的分子基础。基因调控是现代分子生物学研究的中心课题之一。因为要了解动植物生长发育规律。形态结构特征及生物学功能,就必须搞清楚基因表达调控的时间和空间概念,掌握了基因调控机制,就等于掌握了一把揭示生物学奥秘的钥匙。基因表达调控主要表现在以下几个方面:①转录水平上的调控;②mRNA加工、成熟水平上的调控;③翻译水平上的调控;基因表达调控的指挥系统有很多种,不同生物使用不同的信号来指挥基因调控。原核生物和真核生物之间存在着相当大差异。原核生物中,营养状况、环境因素对基因表达起着十分重要的作用;而真核生物尤其是高等真核生物中,激素水平、发育阶段等是基因表达调控的主要手段,营养和环境因素的影响则为次要因素。
巴尔小体的发现过程
1948年加拿大学者穆雷·巴尔和研究生尤尔特·伯特伦(Ewart George Bertram)研究有关疲劳对大脑的影响,观察猫脑组织为样本,以福尔根试剂(Feulgen stain)将细胞核内的DNA染色。在观察一些母猫神经元时,他意外发现在核膜内缘有一小团染色极深的鼓槌状物质(公猫则没有这样的现象),由于神经元细胞当时不是处在细胞分裂状态,DNA应是散落成染色丝,不该结成团状构造。巴尔在观察了其他动物的相关玻片标本后,归纳出一个结论:这些DNA团块是存在雌性哺乳类细胞内的明显差异。次年,巴尔与伯特伦联合出版了一篇论文,发表他所发现的奇异现象,当时他将发现的小团鼓槌状物质称为“性染色质”(Sex chromatin),也就是后人所谓的“巴尔氏体”。1955年,巴尔和解剖学家穆尔(K.L.Moore)观察口腔黏膜发现,女性口腔上皮细胞核膜内缘有同样的小体紧贴在核膜上,而男性却没有。这进一步证明了这个染色较深的小体和性别有关。人们把这个染色较深的小体称为性染色质,又称巴氏小体。1960年,洛杉矶希望之城癌症研究中心的科学家大野干经过彻底研究雌鼠的X染色体后宣布,巴尔氏体其实就是X染色体,隔年英国的遗传学家玛莉·里昂发表了一篇论文,以精简的文字将当时已知的各种现象串连起来,解释巴尔氏体的存在,及它如何以前所未知的方式对哺乳动物造成影响。
巴尔小体的应用
自1968年墨西哥奥运会起,奥运首次开始检测女性运动员的性别,以有巴尔氏体与否做为判断女性的辨识标准,这是区分人类性别的一种简单方式。1992年巴塞罗那夏季奥运会之后,国际奥委会改以用聚合酶链锁反应(PCR)的方法检测Y染色体上的SRY基因。1999年后国际奥委会停止进行性别检测,而只对特定有争议的运动员进行个别检测,其中原因包括其衍伸的性别歧视问题(因为只有女性需要做性别检测),以及生物性别不一定等于基因性别等,即应以运动员体内雄性激素表现量来判定他属于男性或女性的体能,而非染色体。2008年的北京奥运,奥运会首次成立“性别鉴定实验中心”,被怀疑性别的女运动员将到此接受筛检,检测项目包括临床、性激素、基因、染色体等。 比起刻意隐瞒性别者,比较多的情况是性别处于模糊地带或自己不清楚自己的性别,例如其中有的是睾丸女性化综合症(testicular feminization syndrome,FS),该疾病会让XY的男性发育成女性的外表。