PCR的引物怎样设计,
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区.同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构.如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物.
现在可以在这一保守区域里设计一对引物.一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对.
让我们先看看P1引物.一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%.而且四种碱基的分布最好随机.不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在.否则P1引物设计的就不合理.应重新寻找区域设计引物.
同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补.
引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大.但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的.这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率.
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性.
② 产物不能形成二级结构.
③ 引物长度一般在15~30碱基之间.
④ G+C含量在40%~60%之间.
⑤ 碱基要随机分布.
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补.
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补.
⑧ 引物5′端可以修饰.
⑨ 引物3′端不可修饰.
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位.
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否.对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计.
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源.
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域.用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板.实验表明,待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的.
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer.引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性.
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%.其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发.
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性.这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合.若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp.
7.引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性.
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰.3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中,引物3′端不能发生错配.
在标准PCR反应体系中,用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板,按95℃,25s；55℃,25s；72℃,1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的.A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的.
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大.因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性.引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等.
10.密码子的简并
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率.
特殊目的的引物设计将在有关章节讨论.随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,下面将讨论有关引物计算机设计方法.
现有的引物设计软件有primer5.0比较好.
pcr中引物的作用
pcr中引物的作用是作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。扩展资料引物设计的基本原则：1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。3、引物内部不应出现互补序列。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。参考资料来源：百度百科-PCR
【科研】PCR引物设计原则
引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物易产生错误的扩增产物。扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。
遵循原则如下：
1. 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25-35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高 4 倍。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。
2. 引物末端： 引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。
3. 引物G+C：含量 引物的GC含量控制在40%-60%之间。
4. Tm值：引物额外附加序列，即与模板非互配对序列，不应参与引物 Tm 的值计算；正向引物和反向引物的Tm值相差不超过5℃为佳，Tm值调整至55℃ -65℃为佳。
5. 碱基的分布：引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；避免连续出现4个及以上的相同碱基，或者某两个核苷酸连续重复出现（例如，ACCCC或ATATATAT；引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列；两条引物的 3’端避免有3个碱基以上的互补序列。
6. 序列特异性：引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意: PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。
